Pengertian Elektroforesis - Elektroforesis adalah salah satu teknik terpenting yang digunakan oleh ahli biologi molekuler. Elektroforesis asam deoksiribonukleat (DNA) digunakan untuk memetakan urutan fragmen restriksi dalam kromosom, untuk menganalisis variasi DNA dalam suatu populasi dengan membatasi polimorfisme panjang fragmen, dan untuk menentukan urutan nukleotida sepotong DNA.
Elektroforesis mengacu pada migrasi molekul bermuatan melalui matriks restriktif, atau gel, yang ditarik oleh gaya listrik. Saat gaya menyeret molekul melalui gel, ia menghadapi resistensi dari untaian gel, memperlambat laju migrasi. Dalam elektroforesis gel, molekul yang lebih besar bermigrasi lebih lambat daripada yang lebih kecil, sehingga jarak migrasi dalam gel dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul.
Meskipun dimungkinkan untuk memisahkan seluruh kromosom menggunakan teknik elektroforesis khusus, DNA yang akan dianalisis dengan elektroforesis biasanya dipotong menjadi potongan-potongan kecil menggunakan enzim restriksi. Fragmen-fragmen DNA yang dibuat dengan perlakuan dengan enzim restriksi biasanya dipisahkan satu sama lain, dan ukurannya ditentukan, menggunakan gel elektroforesis agarosa, karbohidrat kompleks . DNA bermuatan negatif karena ikatan fosfodiester yang bergabung dengan blok bangunan nukleotida individu. DNA karenanya akan elektroforese menuju elektroda positifketika ditempatkan di medan listrik. Untuk memvisualisasikan hasil setelah elektroforesis, gel direndam dalam larutan yang menyebabkan DNA berpendar saat terpapar sinar ultraviolet .
 |
| Gel elektroforesis, yang dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul. |
Perawatan sampel DNA dengan berbagai enzim restriksi dalam berbagai kombinasi memungkinkan peneliti untuk menghasilkan peta restriksi dari fragmen DNA asli, yang mengidentifikasi DNA di mana enzim restriksi berada.
Banyak pertanyaan penelitian memerlukan analisis terperinci satu fragmen DNA spesifik dalam campuran kompleks. Dalam kasus tersebut, penyelidikan DNA radioaktif dapat digunakan untuk mengidentifikasi fragmen berdasarkan urutan nukleotida. Metode, yang dikenal sebagai hibridisasi, didasarkan pada aturan pairing basis komplementer (ikatan A ke T, ikatan G ke C). Probe dirancang yang urutannya komplementer dengan potongan DNA yang akan dideteksi. DNA yang dipisahkan gel pertama-tama dipindahkan ke membran nilon menggunakan teknik yang disebut Southern blot.
Selama prosedur blotting, untaian dalam heliks ganda DNA dipisahkan satu sama lain, atau didenaturasi, dengan pengobatan dengan basa. Karena DNA beruntai ganda lebih stabil daripada untai tunggal, selama hibridisasi, probe beruntai tunggal akan menemukan dan mengikat fragmen yang dipisahkan gel beruntai tunggal dengan urutan yang saling melengkapi. Menjadi fluorescent atau radioaktif, posisi probe dapat ditentukan dengan menggunakan metode fotografi. Urutan target kemudian dapat dihilangkan dengan memotong bagian gel yang berisi itu.
Elektroforesis asam ribonukleat (RNA) adalah prosedur integral dalam banyak penelitian ekspresi gen . RNA diisolasi, dipisahkan oleh elektroforesis, dan kemudian fragmen RNA yang dipisahkan gel dipindahkan ke membran nilon menggunakan teknik yang disebut Northern blot. Hibridisasi dengan probe DNA beruntai tunggal kemudian digunakan untuk menentukan posisi fragmen RNA tertentu.
DNA dan RNA relatif sederhana dalam hal struktur dan komposisi. Protein , bagaimanapun, terdiri dari dua puluh asam amino yang berbeda dalam berbagai kombinasi, dan protein berbeda secara signifikan dalam struktur tiga dimensi mereka. Komposisi asam amino akan mempengaruhi muatan pada protein, yang pada akhirnya akan mempengaruhi perilaku elektroforesisnya. Bentuk protein yang sama akan mempengaruhi laju migrasi. Akibatnya, teknik khusus, elektroforesis gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE), biasanya digunakan untuk menganalisis protein. Dalam metode ini, sampel protein dipanaskan dan kemudian diperlakukan dengan deterjen natrium dodesil sulfat (SDS). Protein yang diperlakukan dengan cara ini dibuka, linier, dan dilapisi secara seragam oleh molekul deterjen bermuatan negatif. Tingkat migrasi protein yang diolah berbanding terbalik dengan logaritmadari berat molekul. Setelah elektroforesis, protein dalam gel dapat diwarnai untuk memvisualisasikan semua protein dalam sampel, atau protein dalam gel dapat ditransfer ke membran nilon (Western blot) dan yang spesifik terdeteksi dengan menggunakan antibodi yang terhubung dengan enzim .
Terlepas dari makromolekul yang sedang dipelajari, elektroforesis gel adalah teknik penting bagi ahli biologi molekuler. Banyak pertanyaan ilmiah dapat dijawab menggunakan elektroforesis, dan sebagai akibatnya laboratorium penelitian biologi molekuler aktif akan memiliki beberapa bangku yang dikhususkan untuk reagen dan peralatan khusus yang diperlukan.
Daftar Pustaka
Alberts, Bruce, et al. Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Publishing, 2000.
Stryer, Lubert. Biochemistry, 4th ed. New York: W. H. Freeman and Company, 1995.
EmoticonEmoticon